[유전학] 유전자 가위 세대별 특징 알아보기 -1세대 부터 3.5세대 까지

목차

1세대 유전자 가위 (ZFN)

1세대 유전자가위는 아연-손가락 핵산분해효소(ZFN, zinc finger nuclease)이다. 이름에 '손가락'이 들어간 이유는 이 핵산분해 효소가 손가락 형태를 띠는 아프리카 발톱 개구리의 DNA에서 유래했기 때문이다. 이 유전자는 아연과 결합하여 안정적인 구조를 만들기 때문에 아연-손가락이라는 별명을 얻었다. 아연-손가락 단백질은 세 개 정도의 아주 짧은 염기서열을 인식해서 여러 개 이어 붙여야 한다. 그래서 보통 9 - 18개의 염기를 인식하도록 제작하여야 하고 여기에 가위(Fok1) 단백질이 추가된다.

 

Basic structure and design of a zinc finger nuclease (ZFN). ZFNs are created by joining a DNA-binding region to the catalytic domain of the nonspecific Fok1 endonuclease. Zinc fingers are a protein motif capable of DNA binding, whose sequence specificity can be predetermined. Each zinc finger, illustrated by an individual circle, recognizes 3-4 nucleotides, and, by assembling three or four suitable zinc finger motifs, a sequence-specific DNA-binding domain can be created. Fok1 nuclease activity requires dimerization, and so the customized ZFNs function in pairs. As shown, the zinc finger-binding domain brings two Fok1 units together in the right orientation over the target sequence; this induces Fok1 dimerization and target sequence cleavage

 

핵심적인 원리는 개별 원으로 표시된 각 zinc finger는 3-4개의 뉴클레오타이드를 인식하고 3-4개의 적절한 zinc finger motif를 조합해 서열 특이적 DNA 결합 도메인을 만들 수 있다. 이를 통해 표적 서열에 올바른 방향으로 2개의 Fok단백질이 표적 서열의 절단을 유도하게 된다.

 

이러한 방식은 인식 가능한 염기가 열 개 내외이기 때문에 선택성의 문제가 생길 수 있다. 원치 않은 곳을 잘라낼 가능성이 증가하고 이에 따라 선택성을 높이기 위해서 무리하게 숫자를 늘리면 제작 공정이 번거로워진다. 또한 숙주세포가 ZFN에 면역반응이 일어날 수 도 있다.

 

2세대 유전자 가위 (TALEN)

TALEN이라 불리는 인식 체계 단백질은 식물 병원균에서 유래되었다. TALEN은 약 15개 정도의 염기서열을 인식할 수 있다. 1세대에 비해서 선택성이 높아졌다.

 

그림만 봐도 1세대에 비해서 선택성이 높아졌다는 것을 알 수 있다. Fok1 단백질을 사용하는 것을 보아 ZFN의 기본적인 특성을 공유한다는 것을 알 수 있다. 선택성이 높아졌다고 하지만 여전히 복잡하고 효율도 생각만큼 높지는 않다.

 

ZFN과 마찬가지로 TALEN에 의하여 특정 부위가 잘리면 세포는 Repair system을 가동하여 repair를 하게 되는 이중 Non homolojus End-joint 방식에 의하여 수정되게 되며 그 결과로 인하여 특정 부위의 deletion이 일어나게 된다.

3세대 유전자 가위 (CRISPR - Cas9)

 

3세대 유전자가위 CRISPR/Cas9은 박테리아에서 유래되었다. 박테리아가 외부에서 침입하는 바이러스를 막기위한 면역계 시스템에 존재한다. 세균과 바이러스의 군비경쟁으로 만들어졌다고도 비유할 수 있다.

 

바이러스는 짧은 회문 서열(Clustered Regularly interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR)을 가지고 있고 세균은 이를 이용하여 바이러스를 제거한다.

 

바이러스의 유전자중 Target 유전 서열이 크리스퍼 유전자 사이에 끼어들어간다. 크리스퍼는 가이드 RNA로 전사된다. gRNA는 박테리아 바이러스가 다시 재침입할 때 Target DNA를 찾는 탐지기구로 이용된다. gRNA로 target DNA를 찾은 이후 Cas9을 이용해 바이러스 DNA를 절단한다.

 

https://www.addgene.org/guides/crispr/

Addgene: CRISPR Guide

자세한 크리스퍼 유전자가 위에 대해서 알고 싶다면 위의 사이트에 들어가서 보는 것을 추천한다. 유전자가위의 응용에 대해서도

설명되어 있어 크리스퍼를 학습하는 하는 사람에게는 유용할 것이다.

 

3.5세대 유전자 가위 (Cpf1)

 

2015년 MIT의 장펑 연구팀은 크리스퍼와 공동으로 작업하는 3.5세대 유전자가위 'Cpf1'를 발견했다. Cpf1은 카스 유전자가위보다 크기가 작아 크리스퍼-카스9 유전자가위에 비해 정확도가 높다는 점을 한국연구진들이 입증하였다.

 

Cpf1은 나도 공부를 하면서 처음 알게 되었다. 차세대 유전자가위로 Target 유전자와 결합하는 gRNA의 말단에 유리디닐레이트(Uridinylate) 추가를 통해 Cpf1 단백질과 최적화된 CRISPR RNA 간의 결합력을 높임으로 효율성을 CRISPR-Cas9보다 높였다. CRISPR-Cpf1 시스템은 gRNA와 결합된 핵산분해 효소가 표적 유전자를 인식해 교정한다는 점에서 기존 시스템과 동일하지만 염기서열을 인식하는 부위가 다르다.

 

Cas9은 3'말단에 구아닌(G)이 많은 PAM(protospace adjacent motif) 서열을 인식하는 반면, Cpf1은 5'말단에 티민(T)이 많은 PAM 서열을 인식해 Cas9을 사용할 수 없는 표적 서열에도 활용이 가능하다. 또한 기존의 시스템보다 뛰어난 결합력이 보이는 것을 확인됐다.

 

http://www.biospectator.com/view/news_view.php?varAtcId=6307 

가이드 RNA 말단 조작, 'CRISPR-Cpf1' 교정효율 높인다