[단백질 공학] Yeast surface display, MACS, FACS
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Chemical Study/단백질

[단백질 공학] Yeast surface display, MACS, FACS

by Beoms14 2023. 3. 28.
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목차

    Yeast surface display

    효모 세포면에 엔지니어링하고자하는 protein에 target protein을 묶는다.

    이 기술은 다음과 같은 단계로 이루어집니다:

    1. 효모 세포를 재조합 단백질을 담고 있는 표현 벡터로 변형된다.
    2. 변형된 효모 세포를 성장시키면서, 벡터로부터 단백질이 효모 세포의 표면에 노출된다.
    3. 노출된 단백질이 특정 화합물에 결합하는지 검사하기 위해, 특정 표적 화합물과 반응하는 단백질을 표현하는 효모 세포의 분리를 수행한다.
    4. 분리된 세포는 후속 실험을 위해 재생산된다.

    scFV, Fab, T cell receptor, MHC molecules, cytokines, enzyme 등에 사용된다.

    출아형 효모에서는 Aga1 - Aga2 상호작용에 이용된다.
     
     
    Yeast surface display에서 Aga1-Aga2 상호작용은 이스트(효모) 세포의 표면에 노출된 Aga1 단백질과 Aga2 단백질 간의 상호작용을 의미한다.
     

    Aga1-Aga2 상호작용은 이스트 세포의 표면에 노출된 Aga1 단백질이 특정 화합물, 예를 들면 당분 분자와 결합할 수 있는 기능을 가지고 있기 때문에 이러한 상호작용을 사용하여 분자를 분리하거나, 특정 분자와 상호작용하는 단백질을 스크리닝하고 선택할 수 있다.

    Aga1은 이스트 세포의 표면에 노출된 단백질로서, Aga1 자체는 당분 분자와 결합하지 않습니다. 그러나 Aga2는 당분 분자와 강하게 결합하는 단백질로서, Aga1과 Aga2는 단백질-단백질 상호작용을 통해 서로 결합하게 됩니다.

     

    이러한 Aga1-Aga2 상호작용은 효모 세포 표면에 노출된 Aga1을 사용하여 당분 분자를 분리하거나, 당분 분자와 상호작용하는 단백질을 스크리닝하여 선택하는 데 사용됩니다.

     

    따라서, Aga1-Aga2 상호작용은 Yeast surface display 기술에서 중요한 역할을 합니다. 이 기술은 다양한 생명 과학 분야에서 활용되고 있으며, Aga1-Aga2 상호작용은 특히 단백질 엔지니어링, 단백질 분리 및 정제, 항체 스크리닝 등에서 유용하게 활용된다.

     
    Fusion of the target protein with Aga2(yeast agglutinin protein)
     
    Formation of disulfide bands : target protein - Aga2 와 Aga1(cell wall에 공유결합되어져있다.) 사이에 형성되어진다.
     
     
     

    1. Aga1 - Aga2 (free C-terminus)

    2. Aga1 - Aga2 (free N-terminus)

    3. Multimeric display

     

    Yeast surface display의 장점

     

    bacterial surface display에 비해서 efficency - higher libary quality

    Less toxiy (bacterial display system에 비해서) -이유 : Cell wall 이 있기 때문이다.

    Display of glycosylated proteins of yeast

     

    Yeast surface display의 단점

     

    Low transformation efficiency - Cell wall이 두껍기 때문이다.

    Smaller library size
     

    배양시간이 느림 (2-3일 정도 소요)

     

    Mammalian cell display system

     

    다른 display system들에 비해서 높은 수준의 기술을 요구한다.

    scFv anchored to the transmembrane domain of membrane proteins such as hPDGFR (human platelet - derived growth factor receptor)
    Full length IgG display on the surface of B cells or human embryonic kidney cells
    Combined with MACS or FACS for high throughput screening
     

    MACS(magnetic-activated cell sorting), FACS(fluorescence-activated cell sorting), Panning(plate에 binding한 이후 washing하여 찾아내는 과정) 은 library screeing 방법에 해당된다.

     
     
     

    FACS(fluorescence-activated cell sorting)

     

    research 또는 clinical application(임상 단계)에서 사용되어 진다.

     

    FACS는 다음과 같은 단계로 이루어진다.

    1. 세포 샘플은 특정 항체 또는 형광 태그를 가진 다른 화합물과 처리된다.
    2. 세포가 레이저로 조명되면서 형광 신호가 발생하고 각 세포는 특정 형광 신호를 발생시키기 때문에 세포의 특성에 따라 신호 강도가 다르다.
    3. 각 세포의 형광 신호 강도는 형광 속도계(fluorescence detector)에 의해 측정되고, 이를 컴퓨터가 분석하여 세포의 특성에 따라 분류한다.
    4. 분류된 세포는 전기장이 생성되어 해당 위치로 이동하고, 분리기로 이동하여 분리된다.
    Particells와 Cells(bacteria, yeast, insect cells, mamalian cells)에서 이용된다.
    Phage와 mRNA-ribosoe complexes (mRNA display)는 FACS 하기에 너무 작다.
    Affinity 향상을 위해서 protein displayed cells를 형광화시켜 배양을 진행한다. 배양된 library는 washing된 후 분류된다.
    Concertarin of the fluorescent probe, incubation time, washing stringency는 target protein의 결합력에 따라 최적화되고 결정되어진다.
     

    Hight affinity clones을 풍부하게 만들기위해서는 여러 단계의 sorting을 진행해야하고 여러단계의 sorting이후에 scanning과 sequencing이 각각 cells들에 진행된다.

     

    Dual Color sorting

     

    두 개의 fluorescent probe를 이용하여 하나는 probe for normalization of expression level로 다른 하나는 probe for ligand binding affinity에 이용한다. - 두 가지색으로 sorting이 가능함.

    항원-항체가 결합이 강해지면 fluorescent가 높아야함, expression이 많이되어 fluorescent가 높은것은 옳지 않다.

     

    MACS(magnetic-activated cell sorting)

     
     
    Magnetic-activated cell sorting (MACS)은 생물학 실험에서 세포 집합에서 특정 세포를 추출하는 기술이다.
    이 기술은 세포의 표면 단백질에 특이적으로 결합하는 마그넷을 사용한다.
     

    MACS는 다음과 같은 단계로 이루어진다.

    1. 세포 샘플에서 대상 세포를 찾기 위해 특정 항체에 결합한 마그넷을 사용하여 항체-세포 복합체를 형성한다.
    2. 항체-세포 복합체는 마그넷을 사용하여 세포 분리 컬럼(column)을 통과한다.
    3. 마그넷은 분리 컬럼 내부에서 세포를 붙잡고 분리될 대상 세포를 취합한다.
    4. 분리된 대상 세포는 분리 컬럼 외부로 내보내어 다른 실험에 사용한다.
    Sort 10^9 - 10^11 cells per round of sorting , weak binders을 위해서 sorting을 진행한다.
    No quantiatvie control of sorting stringency
     
    cell ratio, washing condition..에 최적화를 요구한다.
     
    high expression과 high avidity effects를 발현하는 clones을 분리시킬 수 있다는 장점이 있다.
     
     
     

    Fluorescence-activated cell sorting 와 Magnetic-activated cell sorting의 공통점과 차이점

     
     

      공통점

    생물학적 샘플에서 특정 세포를 추출하는 데 사용된다.
     

      차이점

    (1) FACS는 세포의 형광신호를 측정하여 분류하지만, MACS는 마그넷을 사용해 세포를 분리한다.

    (2) FACS는 단일 세포 수준에서 정확한 분석이 가능하지만, MACS는 대량의 세포를 분리하는데 용이하다.
    (3) FACS는 보다 정교한 분석이 필요한 실험에서 사용되는 반면, MACS는 상대적으로 단순하고 빠른 세포 분리가 필요한 실험에서 사용된다.
     
     
     

    Panning

     

    광범위하게 phage displayed libraries에 사용되어지고 bacterial 또는 yeast surface display system에서도 사용가능하다.

    Cell panning enables screeing of proteins recognizing ligands immobilezed cells

    원심분리하면 농도에 따라 여러 층이 생성된다.

     

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