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Phage Display 개요
가장 잘 알려진 protein binder selection platform이고 실험 방법이 단순하여 널리 사용되고 Stability와 Affinity를 향상시킨 단백질 변이체를 만들기 위한 방법이다.
주로 실험실 환경(In vitro)에서 진행되는 방법으로 variants of proteins(특정 한원에 결합하는 protein)들은 phage particles의 표면에 생성된다.
응용분야에는 Isolation of high affinity binders, slection of highly stable protien variants, protein - protein interaction 분석, long scale protein function stduy 이 있다.
주로 M13 phage를 이용하고 이외에도 ramda phage, T4 phage, eukaryotic viruses도 이용된다.
Phage Structure
M13의 구조를 보면 P3,P6,P7,P8,P9 총 5개의 외피단백질이 존재한다. 여기서 P는 단백질(portein)을 뜻하고 다수 외피단백질(major coat protein)인 P8은 파지 표면 대부분을 둘러싸고 있으며, P3와 P6는 각각 5개씩 존재하는 소수 외피단백질(minor coat protein)이다. 그 외에 P7, P9 두개의 소수 외피단백질이 존재한다.
이들 5개의 단백질중 phage display에 이용되는 단백질을 P3단백질 분이다. 파지 입자는 유전물질인 DNA가 이들 5개의 외피단백질들에 의해서 보호되고 있는 매우 간단한 구조를 하고 있다.
- Filamentous bacteriophage : 6.5 nm(diameter) / 930 nm(length)
- ssDNA(single strand DNA)
- 2700 copites의 P8, low copies의 P3/P6, capped P7/P9
- Large P3, small P6,P7,P8,P9
P3는 N말단과 C말단에 fusion이 가능하다. N말단은 outer membrane, C말단은 inner membrane에 위치한다.
Characteristics of the phage coate proteins
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Protein
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Number of amino acids
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Molecular weight
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Copies per phage
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Type of display
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P3
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406
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42,500
(42.5kDa)
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5
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N or C
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P6
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112
|
12,300
|
5
|
C
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P7
|
33
|
3,600
|
5
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N
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P8
|
50
|
5,200
|
~270
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N or C
|
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P9
|
32
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3,600
|
5
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N
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Phage Infection
- N1 domain에 TolA protein이 outer membrane에 결합
- 결합될때, disassembly of phage particles
- Insertion of phage genome into the host cell
- ssDNA 은 dsDNA(double strand DNA)로 host cell안에서 전환
- dsDNA는 주형으로 적용되고, 이는 새로운 ssDNA를 통해서 항체가 P3와 결합된 새로운 Phage particles를 만들어낸다.
Hybrid Phage
Filamentous phage display는 대부분 P8 또는 P3의 N-terminus에서 일어난다. 이떄 N-terminus에 fusion하면 해당 유전자는 바깥족(outer membrane, OM)을 향하게 된다. 그리고 coat protein이 바이러스에 infection할때 비효율적이게 되는데 이러한 상황에서 Hybrid Phage가 이용된다.
Hybrid Phage에서 Fusion gene을 phage genome에 넣는데 이때 Phagemid(dsDNA)를 이용한다.
Phagemid는 원하는 유전자의 coat portein을 코딩하는 유전자를 갖고 있고 coat protein을 제외한 다른 유전자들을 모두 포함하는 helper phages을 필요로 한다.
phagemid로 부터 유래된 Copies of target gene-coat protein fusion은 phage particles로 포함되어진다.
P8 : High copy, polyvalent display, selection for low affinity binders
P3 : Low copy, Monovalent display, selection for high affinity binders
Phage display and Library Screening
항체 mRNA들을 PCR을 통해서 cDNA(complementary DNA)로 역전사 될 수 있으며, 증폭된 항체 DNA 절편들을 phagemid라 는 일종의 플라스미드에 클로닝 한다. 이를 대장균에 형질전환 시킨후 이들의 집합체들이 콜로니를 형성하게되고 이를 phage library라 불린다.
Sringency(엄격성)은 round가 진행될수록 증가한다.
결합력(avidity or affinity)을 줄이기 위해서는 amber codon(stop codon)을 넣어야한다. 이를 넣지 않으면 계속 translation이 진행되어 display정도는 감소하게 된다.
